當前位置:學術堂 > 分析化學論文 >

雙醋瑞因膠囊有關物質的HPLC法測定分析
添加時間:2019-09-17

  摘    要: 目的 建立測定雙醋瑞因膠囊有關物質的高效液相色譜 (HPLC) 法。方法 色譜柱采用Kromasil C18柱 (250 mm×4. 6 mm, 5μm) ,流動相為醋酸溶液 (取水1 000 m L,用醋酸調節pH至2. 5) -甲醇-乙腈 (35∶45∶20, V/V/V) ,檢測波長為254 nm,流速為1. 0 m L/min,柱溫為30℃,進樣量為20μL。結果 大黃酸與雙醋瑞因線性回歸方程分別為A大=83 963 C大-787. 71 (r=0. 999 9, n=7) , A雙=6 110 430 C雙+342. 29 (r=1. 000, n=8) 。雙醋瑞因進樣質量濃度在0. 04~2. 02μg/m L范圍內與峰面積線性關系良好。結論修訂系統適用性試驗要求,用含雙醋瑞因、單乙酰大黃酸Ⅰ、單乙酰大黃酸Ⅱ和大黃酸的峰識別對照品為參比物,以相對保留時間作為系統適用性要求和峰識別依據。該方法使用的色譜柱范圍較廣,出峰順序不因色譜柱及流動相比例的改變而改變,分析時間短,效率高,各雜質峰更易分離,易于辨識。

  關鍵詞: 雙醋瑞因; 有關物質; 高效液相色譜法; 質量控制;

  Abstract: Objective To establish an HPLC method for content determination of related substances in Diacerein Capsules. Methods The chromatographic column was Kromasil C18 column ( 250 mm × 4. 6 mm, 5 μm) , the mobile phase was acetic acid solution ( taking 1 000 m L of water and adjusting its pH to 2. 5 with acetic acid) -methanol-acetonitrile ( 35 ∶ 45 ∶ 20, V ∶ V ∶ V) , the detection wavelength was 254 nm, the flow rate was 1. 0 m L/min, the column temperature was 30 ℃ and the sample size was 20 μL. Results The linear regression equation of rhein was A = 83 963 C-787. 71 ( r = 0. 999 9, n = 7) , and that of diacrein was A = 6 110 430 C + 342. 29 ( r = 1. 000 0, n = 8) . The diacerein showed good linear relationship with peak area in the range of 0. 04-2. 02 μg/m L. Conclusion The system suitability test requirements is revised, the reference substance is identified with the peaks of diacetyl, mono acetyl rhubaric acid Ⅰ, mono acetyl rhubaric acid Ⅱ and rhubarb acid, and the relative retention time is used as the requirement of the system applicability and the basis for peak recognition. This method is applicable for a wide range of chromatographic columns. The order of peaks is not easy to change due to the change of column and flow ratio. The analysis time is short, the efficiency is high, and the impurity peaks are easier to be separated and identified.

  Keyword: diacerein; related substance; HPLC; quality control;

  雙醋瑞因 (C19H 12 O 8) 屬蒽醌類藥物,化學名為4, 5-二乙酰氧基-9, 10-二氫-9, 10-二氧代-2蒽羧酸,主要活性代謝產物為大黃酸[1],是骨關節炎發病機制中參與重要炎性反應的白細胞介素1、白細胞介素6和腫瘤壞死因子-α的抑制劑[2,3,4],具有抗炎、鎮痛作用,抑制軟骨降解及破骨細胞性骨破壞[5,6,7,8]的作用,用于治療退行性關節疾病 (骨關節炎及相關疾病) ,可顯著改善骨關節炎及相關疾病引起的疼痛和關節功能障礙等。為提高檢驗效率,參照進口藥品注冊標準,本試驗中采用高效液相色譜 (HPLC) 法測定雙醋瑞因膠囊有關物質[9,10,11,12],修訂系統適用性試驗要求[13,14,15,16],結果各雜質出峰順序不因色譜柱及流動相比例的改變而改變,且雜質峰易分離,便于辨識。現報道如下。

  1、 儀器與試藥

  1.1、 儀器

  Waters E2695型高效液相色譜儀,含Empower工作站、Waters 2489型紫外檢測器 (美國Waters公司) ;MT-5型電子天平 (百萬分之一) 、XS105 DualRange型電子天平 (十萬分之一) ,均購于瑞士梅特勒-托利多公司。

  1.2、 試藥

  樣品:雙醋瑞因膠囊 (某企業,批號分別為A, B, C) ;峰識別對照品 (某企業,批號為371111,含量為100.5%,含雙醋瑞因、單乙酰大黃酸Ⅰ、單乙酰大黃酸Ⅱ和大黃酸) ;大黃酸對照品 (中國食品藥品檢定研究院,批號為110757-200206,含量為100.00%) ;醋酸 (分析純) ;二甲基甲酰胺 (DMF, 99.8%,Merck公司,色譜純) 。
 

雙醋瑞因膠囊有關物質的HPLC法測定分析
 

  2、 方法與結果

  2.1、 溶液制備

  供試品溶液:避光操作,取裝量差異項下粉末,研細,取細粉適量 (約相當于雙醋瑞因50 mg) ,精密稱定,置50 mL容量瓶中,加DMF 40 mL,超聲5 min,振搖使雙醋瑞因溶解,加DMF稀釋至刻度,搖勻,立即精密量取5 m L,置50 m L容量瓶中,用流動相乙腈-甲醇-醋酸溶液 (20∶45∶35, V/V/V) 稀釋至刻度,搖勻,離心,取上清液,即得 (臨用新制) 。

  對照品溶液:取大黃酸對照品約10 mg,精密稱定,置100 mL容量瓶中,加DMF 10 mL溶解,用流動相稀釋至刻度,搖勻,精密量取1 mL,置100 mL容量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻,即得。

  對照溶液與靈敏度試驗溶液:避光操作,精密量取供試品溶液1 mL,置100 mL容量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻,作為對照溶液;精密量取對照溶液1 mL,置20 mL容量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻,作為靈敏度試驗溶液。

  2.2、 色譜條件與系統適用性試驗

  色譜柱:Kromasil C18柱 (250 mm×4.6 mm, 5μm) ;流動相:醋酸溶液 (取水1 000 mL,用醋酸調p H至2.5) -甲醇-乙腈 (35∶45∶20, V/V/V) ;檢測波長:254 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;進樣量:20μL。理論板數按雙醋瑞因峰計應不低于2 000。

  取峰識別對照品適量,加DMF溶解并稀釋成每1 m L約含1 mg的溶液,精密量取,加流動相稀釋成每1 mL含10μg的溶液,量取20μL,注入液相色譜儀,精密量取靈敏度試驗溶液20μL,注入液相色譜儀,雙醋瑞因峰的信噪比大于10。再精密量取供試品溶液、對照溶液和對照品溶液各20μL,分別注入液相色譜儀測定,記錄色譜圖至主成分峰保留時間的3倍。各組分的出峰順序為雙醋瑞因、單乙酰大黃酸Ⅰ、單乙酰大黃酸Ⅱ和大黃酸,相對保留時間分別為1.0, 1.4, 1.8, 2.2 min (圖1) 。

  圖1 系統適用性試驗高效液相色譜圖
圖1 系統適用性試驗高效液相色譜圖

  1.雙醋瑞因2.單乙酸大黃酸Ⅰ3.單乙酸大黃酸Ⅱ4.大黃酸

  2.3、 專屬性試驗

  取樣品粉末適量 (相當于含雙醋瑞因125 mg) ,精密稱定,置50 mL容量瓶中,加DMF溶解并稀釋至刻度,搖勻,精密量取上述溶液5 m L,置50 mL容量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻,作為未破壞樣品貯備液。精密移取未破壞樣品貯備液2。0 m L共4份,分別置10 m L容量瓶中,分別進行如下處理:加1 mol/L鹽酸溶液2。0 mL,室溫下放置5 h后,加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液適量,使之成中性,加流動相稀釋至刻度,搖勻,過濾 (酸破壞) ;加1 mol/L氫氧化鈉溶液2。0 mL,室溫下放置30 min后,加入1 mol/L的鹽酸溶液適量,使之成中性,加流動相稀釋至刻度 (堿破壞) ;加30%過氧化氫溶液2。0 mL,室溫下放置5 h后,加流動相稀釋至刻度 (氧化破壞) ;放于光照強度為4 500 lx的實驗箱中,室溫下放置24 h后,加流動相稀釋至刻度 (光照破壞) 。另外,取雙醋瑞因膠囊內容物 (約相當于雙醋瑞因125 mg) ,精密稱定,放于密封的耐高溫玻璃小瓶中,置80℃高溫6 h,取出,放冷,轉移至50 mL容量瓶中,加DMF溶解并稀釋至刻度,搖勻 (高溫破壞) 。精密量取上述條件處理溶液5 mL,分別置50 mL容量瓶中,加流動相稀釋至刻度,按擬訂色譜條件進樣測定,記錄色譜圖。詳見圖2。

  圖2 專屬性試驗高效液相色譜圖
圖2 專屬性試驗高效液相色譜圖

  A.酸破壞B.堿破壞C.氧化破壞D.光照破壞E.高溫破壞

  可見,酸、堿、氧化、光照、高溫破壞條件下降解產生的雜質峰不干擾主成分峰,主成分峰均一,色譜峰純度大于990,峰純度符合要求,無雜質峰與主成分一起洗脫。結果表明,雙醋瑞因在光照、堿性條件下降解較明顯,酸、高溫、氧化條件下較穩定。樣品記錄色譜圖至3倍主峰保留時間后無超過0.05%限度的降解雜質峰出現,在進行有關物質檢查時樣品記錄色譜圖至3倍主峰保留時間是合適的。同時也表明,本方法可穩定地檢測樣品所發生的降解變化,方法專屬性強。

  2.4、 方法學考察

  線性關系考察:取大黃酸對照品10.104 mg,精密稱定,置100 mL容量瓶中,加入DMF 10 mL使溶解,加入流動相稀釋至刻度,搖勻,精密量取1 mL,置50 m L容量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻,作為大黃酸線性考察溶液 (2.02μg/mL) ;分別量取該溶液適量,置適宜容量瓶中,加流動相稀釋成質量濃度分別為1.20, 1.00, 0.60, 0.20, 0.08, 0.04μg/mL的系列線性考察溶液。按擬訂色譜條件測定,以質量濃度 (C) 為橫坐標、峰面積 (A) 為縱坐標繪制標準曲線,得回歸方程A=83 963 C-787.71, r=0.999 9 (n=7) 。結果表明,大黃酸質量濃度在0.04~2.02μg/m L范圍內與峰面積線性關系良好。取雙醋瑞因膠囊內容物0.262 6 g (平均裝量每粒0.246 31 g,含雙醋瑞因50 mg) ,精密稱定,置50 mL容量瓶中,加DMF至刻度,搖勻;精密量取5 mL,置50 mL容量瓶中,加流動相稀釋至刻度;再取1 mL,置50 mL容量瓶中,加流動相稀釋至刻度,作為自身對照線性考察溶液 (雙醋瑞因質量濃度為2.13μg/mL) ,分別取該溶液適量,置容量瓶中,加流動相稀釋制成質量濃度分別為1.07, 0.64, 0.53, 0.32, 0.11, 0.04, 0.02μg/mL的自身對照系列線性考察溶液。按擬訂色譜條件測定,以質量濃度 (C) 為橫坐標、峰面積 (A) 為縱坐標繪制標準曲線,得回歸方程A=6 110 430 C+342.29, r=1.000 0 (n=8) 。結果表明,雙醋瑞因質量濃度在0.02~2.13μg/m L范圍內與峰面積線性關系良好。

  精密度試驗:精密量取同一大黃酸對照品溶液,每次進樣20μL,重復進樣6次,記錄色譜圖。結果的RSD為0.21% (n=6) ,表明儀器精密度良好。

  檢出限 (LOD) 和定量限 (LOQ) 確定:經試驗,雙醋瑞因及大黃酸的最低LOD (S/N=3) 分別為0。006μg/m L和0。017μg/mL, LOQ (S/N=10) 分別為0。02μg/m L和0。058μg/m L。

  穩定性試驗:取同一供試品溶液 (批號C) ,分別于配置后的0, 2。5, 6, 17, 19, 33 h時進樣分析。結果隨著時間的延長,主成分峰峰面積變化不明顯,但單乙酰大黃酸Ⅰ和單乙酰大黃酸Ⅱ隨著時間的延長峰面積逐漸增加,在33 h時含量分別由0。08%增加至0。16%、由0。05%增加至0。10%,但未見其他雜質峰增加,表明雙醋瑞因在DMF中穩定性較差,應臨用現配,立即用流動相稀釋。

  加樣回收試驗:取大黃酸對照品約5 mg,精密稱定,置100 mL容量瓶中,加DMF溶解并定容至刻度,搖勻,作為貯備溶液。精密量取該貯備溶液1, 2, 3 mL (比例為50%,100%,150%) ,置加入相應空白輔料的100 m L容量瓶中,每個濃度樣品溶液各制備3份,分別進樣,記錄峰面積,按外標法計算大黃酸含量,并計算回收率。結果見表1。

  表1 大黃酸回收試驗結果 (n=9)
表1 大黃酸回收試驗結果 (n=9)

  2.5、 樣品含量測定

  按擬訂色譜條件,對3批樣品進行有關物質檢查,用自身對照法計算各有關物質含量。結果見表2。

  表2 3 批樣品有關物質檢查結果 (%)
表2 3 批樣品有關物質檢查結果 (%)

  3、 討論

  分別考察了3個不同廠家品牌的色譜柱Kromasil C18柱 (250 mm×4.6 mm, 5μm) , Agilent HC-C18柱 (250 mm×4.6 mm, 5μm) , GL ODS-3柱 (250 mm×4.6 mm, 5μm) ,主峰與已知雜質分離度均大于1.5,按雙醋瑞因峰計理論板數均大于3 000,表明本試驗中選定的色譜條件下,各組分峰形分離較好,適用于不同品牌C18柱,耐用性較好,滿足檢驗需求。

  在“藥典在線”網上參照2010年版《印度藥典》,采用與本方法相同的Kromasil C18柱 (250 mm×4.6 mm, 5μm) ,流動相為0.2%磷酸溶液-乙腈 (62∶38, V/V) ,檢測波長為254 nm,流速為1.0 mL/min,柱溫為30℃,進樣量為20μL,測得單乙酰大黃酸Ⅰ、單乙酰大黃酸Ⅱ、大黃酸的分離度分別為2.273, 2.383, 1.151,分離度較高,結果與本方法基本一致。

  為考察色譜條件的微小變化對各有關物質測定結果的影響程度,本試驗考察了流動相比例 (醋酸水溶液-甲醇-乙腈 (30∶47.5∶22.5, V/V/V) 即水相30%,以及醋酸水溶液-甲醇-乙腈 (40∶42.5∶17.5, V/V/V) 即水相40%及pH (±0.2) 即pH 2.3及p H2.7的變化對測定結果的影響,有關物質測定結果差異不大 (RSD<2.0%) ,均未檢出其他最大單個未知雜質峰,表明本試驗中選定的色譜條件下,各組分峰形分離較好。

  本研究中色譜條件采用醋酸溶液 (取水1 000 mL,用醋酸調節pH至2.5) -甲醇-乙腈 (35∶45∶20, V/V/V) 為流動相,各雜質的出峰順序不易因色譜柱及流動相比例的改變而改變,在使用不同品牌C18柱時無差異,因此適用的色譜柱范圍較廣,避免因所用色譜柱柱效下降、分離度變差、已知雜質可能發生色譜峰重疊、未知雜質可能被誤認為已知雜質而導致雜質誤判的情況。同時,修訂系統適用性試驗要求,用含雙醋瑞因、單乙酰大黃酸Ⅰ、單乙酰大黃酸Ⅱ和大黃酸的峰識別對照品為參比物,以相對保留時間作為系統適用性的要求和峰識別依據,方法更清晰、明了;由于該系統條件運行一針的時間短,能有效提高檢驗效率。

  綜上所述,本試驗中建立的系統條件適用于雙醋瑞因膠囊有關物質的測定,適用的色譜柱范圍較廣,各雜質峰易分離,試驗效率高,結果準確可靠。

  參考文獻

  [1]張毅,王建塔,許潔,等.雙醋瑞因的合成及質量研究[J].化學試劑,2014, 36 (3) :273-275.
  [2]于琴,葛躍君,劉美花.RP-HPLC法測定雙醋瑞因含量及有關物質[J].山東化工,2013, 42 (6) :20-22.
  [3]陶蕾,薛建峰,李興福.雙醋瑞因在骨關節炎治療中的應用[J].醫學綜述,2013, 19 (4) :700-701.
  [4]楊娜,胡家才,鄧巧麗,等.雙醋瑞因聯合依托考昔治療急性痛風性關節炎療效觀察[J].現代中西醫結合雜志,2018, 27 (6) :601-604.
  [5]羅建軍.塞來昔布聯合雙醋瑞因治療膝骨關節炎的臨床療效[J].實用中西醫結合臨床,2018, 18 (5) :23-24.
  [6]余珊.解熱鎮痛藥的臨床應用與不良反應分析[J].中國處方藥,2018, 16 (1) :46-47.
  [7]陳平國,齊亮,羅文軒.針刺配合雙醋瑞因口服治療膝骨性關節炎的臨床觀察[J].頸腰痛雜志,2014, 35 (5) :397-398.
  [8]朱麗娟,納世麗,康麗.鹽酸氨基葡萄糖聯合雙醋瑞因治療膝骨關節炎的臨床觀察[J].當代醫學,2018, 24 (15) :97-99.
  [9]苑洪忠,于文國,趙孝先,等.雙醋瑞因有關物質的HPLC法測定[J].中國醫藥工業雜志,2016, 47 (4) :459-463.
  [10]李琳,劉家鑫,龍猜,等.HPLC法測定伏立康唑眼用凝膠中有關物質的含量[J].沈陽藥科大學學報,2018, 35 (7) :555-562.
  [11]黃巧巧,陳雪凡,李會林.高效液相色譜法測定雙醋瑞因含量與有關物質[J].醫藥導報,2007, 26 (9) :1077-1078.
  [12]董順玲,張麗容.RP-HPLC法測定雙醋瑞因膠囊的含量與有關物質[J].中醫研究,2006, 3 (19) :30-31.
  [13]張艷,楊穎.高效液相色譜法測定諾氟沙星滴眼液中羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯含量[J].中國藥業,2017, 26 (21) :20-22.
  [14]于文萃,高毓濤.HPLC法測定復方氨酚那敏顆粒中3種組分的含量[J].今日藥學,2018, 24 (3) :155-158.
  [15]李娜,秦松,高海燕.HPLC法測定雙黃連合劑中黃芩苷含量[J].中國衛生工程學,2018, 17 (2) :256-257.
  [16]侯曉蓉,張煥鑫,葉永臻,等.HPLC法檢測醋氯芬酸有關物質及主要雜質鑒別[J].藥物分析雜志,2018, 38 (7) :1217-1225.

上一篇:沒有了
下一篇:熒光碳點在環境監測中的運用

相關內容推薦
在線咨詢
快三平台-首页 巴黎好运彩-官网 3D预测-首页 一分排列3-首页 五分快三-官网 旺旺时时彩-首页