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微囊藻毒素檢測中芯片液相色譜和高分辨質譜技術的應用
添加時間:2019-06-28

  摘    要: 建立了一種芯片液相色譜-高分辨質譜測定3種微囊藻毒素 (MC-RR、MC-YR和MC-LR) 的分析方法.在最優條件下, 3種藻毒素在16 min內實現基線分離, 并選擇電噴霧源正離子模式進行質譜測定.方法在2.5~2 000 ng/m L范圍內線性良好, 線性相關系數大于0.996 5, 檢測限介于0.5~2.0 ng/m L之間.魚肉和蝦肉樣品經固相萃取法凈化處理后未測得上述毒素殘留, 加標回收率為82.8%~120.3%.方法具有樣品用量少、定性快速準確、靈敏度高等優點, 適合用于水產品等生物樣品中藻毒素的痕量監測.

  關鍵詞: 微囊藻毒素; 芯片液相色譜; 質譜; 水產品;

  Abstract: A method for the simultaneous analysis of 3 microcystins ( MC-RR, MC-YR and MC-LR) was set up by the nano-flow chip liquid chromatography-high resolution mass spectrometry. Under optimal conditions, the mentioned microcystins were baseline separated in 16 min with an ESI source in the positive ion mode. Good linear range in 2.5 ~ 2 000 ng/m L was obtained, with the correlation coefficient larger than 0.996 5 and the limit of detection between 0.5 ~ 2.0 ng/m L.Solid phase extraction method was used for the extraction and clean-up of fish and shrimp samples. No residue of the three microcystins was detected and the spiked recoveries were between 82. 8% ~ 120. 3%. The developed method is sensitive, rapid and exact with low sample consumption, so it is reliable for the trace determination of microcystins in biological samples including aquatic products.

  Keyword: microcystins; nano-flow chip liquid chromatography; mass spectrometry; aquatic product;

  藍藻水華是常見的淡水水華現象, 產生的毒素以微囊藻毒素 (MCs) 最普遍且危害最大[1,2].大量藻毒素的存在不僅影響生態環境, 還會通過食物鏈富集和傳遞, 影響淡水養殖業并威脅人類健康.MCs是一類由7個氨基酸殘基組成的環狀多肽化合物目前已發現了幾十種該類毒素, 其中MC-RR、MC-LR和MC-YR最具有代表性, 其測定技術包括生物學法、免疫檢測法和化學分析法等[3].化學分析法中, HPLC是推薦的MCs測定方法.痕量毒素通常需要先濃縮富集再經HPLC-UV法直接測定[4,5].此法結合質譜檢測器, 方法的靈敏度和定性準確性明顯提高, 但較大的進樣量和較低的柱效在常規HPLC-MS或HPLC-MS/MS中略顯不足[6,7].因此, 開發一種高效、樣品消耗少的MCs檢測方法仍具有實際意義.

  芯片色譜技術把傳統色譜柱濃縮成約數厘米長、數毫米厚的芯片, 再通過激光鐳射技術在色譜芯片上刻出分析通道, 并填充C18、C8等固定相.該微型化裝置可明顯降低流速、減少柱體積, 從而提高方法靈敏度[8,9].目前芯片液相色譜-質譜 (nano-flow chip liquid chromatography-high resolution mass, nano-flow chip LC-MS) 技術已成功應用于蛋白質、肽類等生物樣品分析[10,11,12], 但較少用于小分子化合物領域[13,14,15], 在MCs定量監測中也鮮見報道.

微囊藻毒素檢測中芯片液相色譜和高分辨質譜技術的應用

  本文將芯片液相色譜和高分辨質譜技術相結合, 建立了同時檢測MC-RR、MC-LR和MC-YR的nano-flow chip LC-MS新體系.方法快速可靠, 僅pg級的進樣量也獲得了較高的靈敏度.

  1、 試驗部分

  1.1、 儀器與試劑

  Nano-flow chip LC-MS聯用系統 (Agilent, USA) 包括納流液相色譜 (1200 Nano HPLC) 、接口 (Chip Cube) 和四級桿-飛行時間質譜儀 (G6520Q-TOF MS) 3部分。芯片為Agilent G4240-65005, 包括富集柱 (體積40 nL) 和分析柱 (75μm×43 mm) , 二者填料均為Zorbax SB-C18, 5μm (如圖1所示) 。

  圖1 MCs的化學結構 (a) 和芯片示意圖 (b)
圖1 MCs的化學結構 (a) 和芯片示意圖 (b)

  Fig.1 Chemical structure of MCs (a) and schematic diagram of chip (b)

  標準品MC-RR、MC-LR和MC-YR (北京伊普瑞斯公司, 結構式如圖1所示) 使用甲醇∶水 (體積比為2∶8) 溶解, 配制成100。0μg/m L儲備液, 試驗前用二次水稀釋至所需濃度。乙腈為色譜純 (美國Sigma-aldrich公司) ;醋酸銨為分析純 (天津市福晨化學試劑廠) ;甲酸 (FA) 為色譜純 (上海迪馬科技有限公司) 。Bond Elut-C18固相萃取柱 (Agilent, USA) 。試驗用水為二次蒸餾水, 取自Milli-Q超純水系統。所有溶液使用前均用0。22μm濾膜過濾。

  1.2、 芯片液相色譜-質譜條件

  毛細管泵流速2μL/min, 泵沖洗選擇乙腈-水溶液, 10%乙腈等度洗脫.納流泵流速600 n L/min, 乙腈 (B相) -水溶液 (A相, 含0.15%FA) .0~20 min, 10%~60%B相梯度洗脫.進樣體積lμL, 進樣沖洗體積為4μL.

  質譜選擇正離子模式;m/z 400-1200, 干燥氣流量3 L/min, 霧化氣溫度315℃, Fragmentor 175 V, 毛細管電壓調節在1 750 V使噴霧良好.3種MCs均測得[M+H]+、[M+2H]2+信號, 試驗以[M+2H]2+作為定量離子 (如表1所列) .

  1.3、 樣品處理

  明蝦和草魚購于福州當地超市.采用固相萃取法 (SPE) 提取凈化樣品, 過程在文獻[7]基礎上稍加改進.準確稱取魚肉或蝦肉組織1.0 g, 加入5.0 m L 5%醋酸銨溶液, 勻漿攪碎, 超聲20 min, 浸提4 h.過濾, 殘渣用2.5 m L 5%醋酸銨溶液重復提取兩次, 合并濾液.分別用甲醇、水活化處理C18小柱后, 讓濾液以一定速度上樣富集藻毒素.待樣品全部吸附, 以5.0 m L 10%甲醇-水溶液沖洗C18小柱, 5.0 m L甲醇洗脫目標物, 洗脫液氮吹近干, 用二次水定容至1.0 m L, 15 000 r/min離心10 min, 取上清液進行色譜、質譜分析.

  表1 3種MCs的保留時間和特征離子
表1 3種MCs的保留時間和特征離子

  2、 結果與討論

  2.1、 芯片液相色譜分離優化

  芯片液相色譜高度集成了芯片色譜柱分離和預富集、納流噴霧電離等技術, 高度智能化、微型化的同時也具有較好的色譜分離性能.

  2.1.1、 樣品溶劑和上樣體積的選擇

  在芯片中, 樣品先預富集在富集柱上 (柱體積僅40 nL) , 達到設定的上樣體積時, 六通閥切換使樣品在納流泵的沖洗下進入分析柱 (圖1b) .若稀釋樣品的溶劑洗脫強度較大, 則可能導致在預富集柱中的樣品部分排入廢液或后續分離時峰展寬.試驗考察了5%乙腈-水、2%乙腈-水、水作為樣品溶劑時, 樣品的分離效果.結果發現, 即使添加少量乙腈, 3種分析物峰形都略微展寬, 最終選擇使用水作為樣品溶劑.

  選擇合適的上樣體積, 對樣品的測定非常重要體積太小, 不能保證將所有目標物運送至富集柱;若體積太大, 可能會導致弱保留化合物穿透富集柱鑒于上樣體積一般為針座毛細管體積、自動進樣器到Chip Cube之間毛細管體積、在線過濾器體積之和的2~6倍, 試驗選擇4μL為上樣體積。

  2.1.2、 流動相選擇

  對于芯片色譜而言, 流動相對色譜分離的影響甚大。芯片的耐受壓力約為15 MPa, 若使用甲醇-水體系, 較高的壓力可能超過芯片的承受范圍。使用乙腈-水體系, 系統壓力更低, 而且乙腈具有較強的洗脫能力, 能夠獲得更好的峰形。因此, 選擇乙腈-水作為流動相。

  MCs結構中含有多種氨基酸, 其極性會隨pH值改變而變化.試驗分別考察了甲酸體積分數為0.05%~0.15%時, 目標物的分離情況 (如圖2所示) 由圖2可見, 僅使用乙腈-水二元體系時, MC-YR和MC-LR基本重合.隨著甲酸體積濃度增大, 3種物質的分離度增大, 響應增強.這是因為隨著甲酸濃度的增加, 促進了MCs的質子化過程和極性差異情況, 從而明顯改善了各組分在芯片上的保留行為.因此, 最終選取體積分數為0.15%的甲酸作為水相添加劑.

  圖2 不同流動相對分離的影響
圖2 不同流動相對分離的影響

  Fig.2 Effects of different mobile phase on separation

  (a) 乙腈-H2O, (b) 乙腈-0.05%FA, (c) 乙腈-0.10%FA, (d) 乙腈-0.15%FA毛細管泵流速2μL/min, 10%乙腈等度洗脫;納流泵流速600 n L/min, 0~20 min, 10-60%B相梯度洗脫進樣體積lμL, 進樣沖洗體積為4μL (1) MC-RR (0.5μg/m L) , (2) MC-YR (2.0μg/m L) , (3) MC-LR (1.0μg/m L)

  梯度洗脫有助于進一步改善分離效果.嘗試了多種梯度洗脫程序 (如圖3所示) , 發現增大泵流速或有機相比例, 可使保留時間縮短.以20%乙腈為初始有機相沖洗色譜柱時, 盡管3種待測物在14 min內完成分離, 但柱效和靈敏度都明顯下降.兼顧分離效率和方法靈敏度, 選擇0~20 min、10%~60%B作為后續分析條件.

  圖3 不同梯度洗脫條件對分離的影響
圖3 不同梯度洗脫條件對分離的影響

  Fig.3 Effects of different gradient elutions on separation

  乙腈-0.15%FA;毛細管泵流速2μL/min, 10%乙腈等度洗脫;進樣體積1μL, 進樣沖洗體積為4μL (1) MC-RR (0.5μg/m L) , (2) MC-YR (2.0μg/m L) , (3) MC-LR (1.0μg/m L)

  2.2、 質譜檢測

  在芯片液相色譜-質譜中, 流動相組成、芯片噴針位置、芯片差異等因素都會影響納流噴霧效果。在色譜分離方面, 已證實流動相中添加少量FA有利于改善噴霧情況。試驗繼續考察芯片因素對分離檢測的影響, 結果顯示, 微調芯片噴針位置, 目標物的響應信號會隨之改變。故所有試驗應確保在同一個芯片上進行, 且噴針位置一經確定后不再改變。根據噴霧狀態優化毛細管電壓 (1 500~2 000 V) , 最終確定為1 750 V, 在此條件下方法靈敏度更高。

  MCs結構中含有氨基、羧基和酰胺基, 理論上對質譜的正、負兩種離子檢測模式都有響應。試驗優化了上述兩種檢測模式下的物質信號情況, 也證實了含氮雜原子的存在, 使得正離子檢測模式下目標物的響應峰面積更高。3種MCs均測得[M+H]+、[M+2H]2+信號, 選擇響應較強的[M+2H]2+作為定量離子 (如圖4所示) 。在高分辨質譜中, 所有目標物的質量偏差更小, 定性準確性更強。

  圖4 正離子檢測模式下3種MCs的全掃描質譜圖
圖4 正離子檢測模式下3種MCs的全掃描質譜圖

  Fig.4 Mass spectra of three MCs under full scan with positive mode

  2.3 、定量方法建立

  配制一系列不同濃度的MCs標準混合溶液.選擇[M+2H]2+的峰面積定量分析, 繪制標準工作曲線.3種MCs在2.5~2 000 ng/m L范圍內線性良好, 相關系數大于0.996 5, 檢測限 (LOD) 最低為0.5 ng/m L (如表2所列) .目前, 我國對水產品中MCs殘留未有明確限量, 但已規定在飲用水中MC-LR限量值為1.0 ng/m L[16].該方法MC-LR的檢測限為0.8 ng/m L, 因此能滿足痕量MCs日常監測的要求.

  考察方法的重現性.日間精密度以當天7次重復進樣, 日間精密度以連續3天進樣.結果表明, MCs的保留時間穩定, 峰面積RSDs小于6.81%, 方法重現性良好.

  表2 3種MCs的分析參數
表2 3種MCs的分析參數

  2.4、 水產品樣品分析

  分別對魚肉和蝦肉按照1。3節方法進行處理。樣品組織經醋酸銨提取、C18凈化富集進行質譜分析。對照目標物保留時間、精確質荷比等信息, 表明在實際樣品中未檢出MCs。在最優條件下, 進行加標回收率試驗 (如表3所列) 。所有樣品的回收率大于82。8%~120。3%, 能夠滿足分析方法的要求。

  表3 水產品的加標回收率
表3 水產品的加標回收率

  2.5、 方法對比

  將該方法與已報道的HPLC有關方法相比較 (如表4所列) .由表4可見, 在進樣體積方面, 本法的進樣體積遠低于其他方法, 這對于某些昂貴或稀少樣品特別重要, 并符合綠色化學的要求.其次, 結合經典的SPE預處理方法, 本試驗的靈敏度可達pg級, 線性范圍更廣.常規的HPLC-UV法通常需要結合一些新興樣品前處理技術 (例如固相微萃取和磁性固相萃取) 和制備新型吸附材料, 才能獲得和本方法接近的靈敏度.此外, 串聯質譜技術具有選擇離子、提取離子等功能, 可適用于復雜樣品分析.綜上所述, 本法集成樣品預富集、分離、噴霧于一塊芯片上, 操作簡單、快速, 并具有樣品消耗量少、檢測限低等突出優勢.

  表4 本法與HPLC相關方法比較
表4 本法與HPLC相關方法比較

  3 、結論

  試驗利用nano-flow chip LC-MS技術, 建立了同時分析3種微囊藻毒素的方法.方法檢測限在0.5~2.0 ng/m L范圍內.采用固相萃取法純化2種水產品, 均沒有測得藻毒素殘留.方法簡單、靈敏、環境友好, 可推廣至其他復雜基質中MCs的快速準確分析.

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