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糖基轉移酶與三萜皂苷的合成研究
添加時間:2019-08-21

  摘要:三萜皂苷類化合物通常由一個或多個糖基連接在疏水的皂苷元上構成,其作為傳統中草藥的活性成分有著廣泛應用。三萜皂苷類化合物的傳統獲取方法是從植物中提取,由于植物中三萜皂苷類化合物含量較低,植物生長受到土地資源、氣候、環境等因素影響較大,嚴重制約了其大規模推廣和應用。利用合成生物學技術,設計構建微生物細胞工廠合成三萜皂苷類化合物被認為是一種變革性的生產方法,成為新的研究熱點。在三萜皂苷類化合物的合成過程中,糖基轉移酶起著重要作用。本文將闡述利用糖基轉移酶合成三萜皂苷類化合物的研究進展,為三萜皂苷類化合物的進一步應用提供參考。

  關鍵詞:三萜皂苷; 糖基化; 糖基轉移酶; 合成生物學;

  作者簡介: 李諾楠(1995—),女,碩士研究生,lnuonan@163。com; 李春(1970—),男,博士,教授,lichun@bit。edu。cn;

  收稿日期:2019-05-31

  基金: 國家自然科學基金重點項目(21736002);

  The applications of glycosyltransferases in the synthesis of triterpenoid saponins

  LI Nuonan LI Chun

  School of Chemistry and Chemical Engineering, Beijing Institute of Technology The State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology

  Abstract:Triterpenoid saponins are usually composed of one or more glycosyl groups attached to hydrophobic aglycones, which are widely used as active ingredients in traditional Chinese herbal medicines. The traditional method for obtaining triterpenoid saponins is extracted from plants, due to the low content of triterpenoid saponins in plants and the limitation of plant growth by land resources, climate and environment, it has greatly restricted its large-scale promotion and application. Thus,It’s hard to be applied and popularized on large scale. The use of synthetic biology principles to design and construct microbial cell factories to synthesize triterpenoids is considered to be the most promising alternative and has become a new research hotspot. Glycosyltransferases play a key role in the synthesis of triterpenoid saponins. This article will describe the research progress in the synthesis of triterpenoid saponins using glycosyltransferases, and provide a reference for the further application of triterpenoid saponins.

  Keyword:triterpenoid saponins; glycosylation; glycosyltransferases; synthetic biology;

  Received: 2019-05-31

  引 言

  三萜類化合物是一類由6個異戊二烯單元(C5H8)組成的結構多樣的化合物,在植物中這類化合物常以其糖基化形式存儲[1]——即三萜皂苷。三萜皂苷由疏水的三萜皂苷元連接一個或多個糖基構成[2,3](圖1)。植物體內的三萜皂苷類化合物在植物體防御微生物和食草動物侵害及信號傳導等方面起到重要作用[2]。現代藥理學研究證實,一些三萜皂苷類化合物對人體也有很強的生理活性,因此存在較高的藥用價值[2],在醫療健康行業[4]、食品行業[5,6]、農業[7]等方面均有應用,受到廣泛關注。三萜皂苷類化合物的傳統制備方法是從植物中提取,但由于植物中含量較低[5,8],且提取工藝復雜,加之植物生長周期較長,受到氣候環境等因素影響較大[9],無法為天然產物提取提供穩定的原料來源,極大地限制了其大規模生產。此外,也有利用植物細胞培養的方法生產這類化合物[10],但由于培養植物細胞所需周期長、操作復雜且生產成本較高,并且存在目標代謝產物的產量不穩定等問題[11],難以進行工業化生產;化學合成法方面,由于這類天然產物結構較復雜,合成過程繁瑣,合成的產物中存在手性異構體難以分離,不易實現工業化。微生物由于具有培養周期短,可利用廉價碳源,適于進行大規模發酵等優點,為解決植物天然產物獲取過程中存在的資源短缺和環境污染等問題提供了新的思路[12]。運用合成生物學方法構建用于生產三萜皂苷類化合物的微生物細胞工廠已成為熱門研究課題。

  圖1 部分三萜皂苷類化合物結構式  

  Fig.1 Structural formulae of some triterpenoid saponins

  利用合成生物學方法,構建微生物細胞工廠生產植物天然產物的關鍵是對其代謝途徑進行解析,挖掘關鍵基因元件并對其進行優化,提高外源基因與底盤宿主的適配性,進而對代謝途徑進行優化。在三萜皂苷類化合物合成過程中,三萜骨架的糖基化是關鍵的反應,它利用糖基轉移酶使糖基和天然產物之間形成特定的糖苷鍵來合成糖苷類化合物。本文在對三萜皂苷應用前景與制備現狀進行分析的基礎上,綜述了糖基轉移酶及其在三萜皂苷合成中的應用,為三萜皂苷類化合物未來的工業化生產提供思路。

  1 三萜皂苷的應用前景及制備現狀

  1.1 三萜皂苷的應用前景

  在植物中,三萜皂苷類化合物被認為是植物抵御病原微生物和食草動物侵害的一種自我保護機制[9,13],在植物防御侵害和信號傳導等方面均起著重要作用[14]。由于這些化合物對人體也有生理活性[15],因此除了在醫藥領域,在與人類密切相關的其它領域如食品、藥品、化妝品等領域也都有廣泛需求。例如,被譽為“神草”的人參作為一種傳統的名貴中藥,在我國的使用歷史已有上千年,《神農本草經》記載人參具有安神,明目,延年益壽的功效。人參皂苷是一類以原人參二醇、原人參三醇、齊墩果酸為苷元的糖基化產物的總稱[16],現代藥理學研究證實,人參及人參制品發揮臨床藥理作用主要是由于三萜皂苷類化合物在這些疾病的治療中發揮著作用[4,17]。人參皂苷提取物被廣泛應用到各個領域,市面上已有多種人參皂苷提取物相關的食品、保健品和藥品銷售。與人參同屬五加科的常春藤因其四季常青的特點常被用作裝飾植物,從常春藤的葉子中提取得到的常春藤提取物在抗氧化[18]、抗腫瘤[19]等方面均表現出較強的效果,通過對其提取物成分進行HPLC分析,結果表明常春藤提取物種中含有多種齊墩果烷型三萜皂苷[20]。作為傳統中藥的甘草,其有效成分甘草酸也是一種三萜皂苷,具有保肝護肝、抗炎、平喘等功效[5],在藥品、化妝品等行業有廣泛應用,同時,因甘草酸具有甜味,也被用作甜味劑添加到食品中[21]。由于三萜皂苷類化合物的需求廣泛,因此,如何高效獲取這類化合物成為了人們關注的焦點。

  1.2 三萜皂苷的制備現狀

  長久以來,獲取三萜皂苷類化合物的方式主要是從植物中提取,如從甘草中提取的甘草酸[22]、從人參中提取的人參皂苷[23]。隨著社會的發展,這種生產方式所帶來的弊端也日益顯現。首先,栽培植物會占用土地資源,植物的生長周期一般較長且植株生長受到光照、溫度、氣候等因素影響較大;其次,這些三萜皂苷類化合物大多屬于植物次級代謝產物,在植物中含量較低,且含量受到環境因素影響較大[24,25];除此之外,從植物中提取這些化合物的過程較繁瑣,涉及到研磨粉碎、萃取、分離、濃縮、干燥、結晶等步驟[22],提取效率較低,提取過程中需用到大量有機試劑作為溶劑,所產生的廢液也會對環境造成污染。

  細胞全能性理論的提出為獲取天然產物開辟了一條新的路徑,即通過植物細胞培養的方法獲取植物天然產物,但植物細胞培養也存在著對營養要求嚴苛、培養過程中易出現褐化現象等問題[26];此外,不同細胞系之間合成天然產物的能力存在較大差異,如何篩選得到穩定的高產細胞系也是研究人員面臨的一大難題,植物細胞難以進行大規模培養,這也阻礙了其工業化應用。

  除了以上兩種方法外,化學合成法在三萜皂苷合成中也難以實現大規模應用。由于三萜皂苷結構復雜,化學合成步驟繁瑣,所需反應條件嚴苛、且合成過程中可能存在難分離的手性化合物,這些因素使得化學合成法在經濟效益上不具備競爭力,難以進行推廣。

  面對這些問題,人們迫切地需要一種綠色的、可持續的、經濟效益高的生產模式來突破傳統生產方法的困境。微生物具備培養周期短、可利用廉價碳源等優勢,為可持續發展提供了可能。為解決傳統的制備方法帶來的弊端,研究人員積極探索利用微生物來構建細胞工廠,實現高效綠色地生產植物天然產物,為此做出了許多嘗試,通過利用微生物合成萜類及皂苷類化合物已經取得了一些不錯的成果。2013年,Keasling等人在抗瘧疾藥物前體青蒿酸的合成中取得的成功為人們提供了極大的信心[27],此后,越來越多的結構更復雜的皂苷類化合物被合成,如多種人參皂苷[28,29,30,31]、積雪草皂苷[32,33],常春藤皂苷[34,35,36]等。而在利用微生物合成天然產物的過程中,目標基因元件的挖掘對于解析天然產物的合成途徑至關重要。

  在生物體內,萜類化合物主要是由異戊烯基焦磷酸(IPP)單元聚合而成,IPP主要由甲羥戊酸途徑(MVA途徑)和甲基赤蘚糖-4-磷酸途徑(MEP途徑)產生(圖2)。在自然界中,三萜和倍半萜通過MVA途徑合成,而單萜、二萜和四萜通過MEP途徑合成(圖2)[2]。在三萜皂苷的合成過程中,第一個造成三萜骨架多樣化的反應是氧化鯊烯環化酶(OSC)催化的環化反應,不同的植物體內含有種類多樣的OSC酶,可以催化形成不同的三萜基本骨架。隨后細胞色素P450酶(CYP450)對三萜骨架進行修飾,得到引入功能性官能團(-OH,-COOH等)的皂苷元[37,38]。CYP450功能的多樣性進一步導致了形成的三萜產物的多樣性,同時,CYP450修飾使得進一步的糖基化修飾成為可能,也改善了萜類化合物的水溶性和生物活性[2]。在植物天然產物的合成中,催化糖基化反應的酶主要是UDP-糖基轉移酶(UGT),這類酶以核苷酸糖作為糖基供體,三萜皂苷元作為糖基受體,在UGT的催化下,二者之間可以形成糖苷鍵,生成三萜皂苷[39]。

  圖2 MVA 途徑和MEP途徑示意圖  

  Fig.2 Schematic diagram of MVA pathway and MEP pathway

  1.3 三萜皂苷合成相關基因的挖掘

  通過對植物天然產物代謝途徑進行解析,可以挖掘植物天然產物代謝途徑的特征基因元件,進而實現三萜皂苷的高效生產。

  隨著測序技術的不斷變革和進步,越來越多的非模式植物尤其是藥用植物的基因組相繼被解析[8,40,41]。測序信息有助于預測三萜皂苷合成相關的基因[42],通過差異轉錄組測序分析挖掘候選基因,如通過比較高產和低產植物或組織之間的轉錄組差異,可以挖掘出三萜皂苷合成相關的關鍵基因。例如,通過對甘草的轉錄組數據進行分析,Liu等[43]挖掘到了773個與甘草中次級代謝產物合成相關的基因,40個萜類化合物骨架合成相關的基因,16個與甘草酸合成相關的基因。在竹節參的轉錄組分析中[17],Zhang等通過對竹節參的轉錄組重頭組裝以及高通量RNA-seq分析,從19。6 Gbp的轉錄組數據中發現了66,403條 Unigenes,并對其中34,639條Unigenes進行了注釋,在這其中預測出了與皂苷骨架修飾相關的34個細胞色素P450酶基因和18個UDP-糖基轉移酶基因。Tang等[44]從姜狀三七(一種人參屬植物)的轉錄組中首次挖掘到了4種齊墩果酸葡萄糖醛酸基轉移酶,能特異性地在齊墩果酸的C-3位羥基上轉移葡萄糖醛酸基團,生成齊墩果酸3-O-β-葡萄糖醛酸,為合成齊墩果酸型人參皂苷打下了良好的基礎。

  除了挖掘底物特異性強的酶,也有學者將底物雜泛性的酶應用到天然產物合成途徑中。Dai等[45]就利用一種來自于枯草芽孢桿菌168(Bacillus subtilis 168)的糖基轉移酶Bs-YjiC來合成人參皂苷,體外實驗證實,以原人參三醇(PPT)作為糖基受體,UDP-葡萄糖作為糖基供體時,Bs-YjiC能將葡萄糖基團轉移到PPT的C3位OH,C6位OH和C12位OH上,合成了五種PPT型人參皂苷,其中包括人參皂苷Rh1和四種非天然的人參皂苷,表明來自于微生物的底物雜泛性的糖基轉移酶在合成新型人參皂苷方面具有很大的潛力。而另一種來自于枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis的底物雜泛性的酶UGT109A1也展示出極強的底物雜泛性,將UGT109A1在大腸桿菌中異源表達,分別以人參皂苷Re、Rf、Rh1、和R1作為糖基受體,UDP-糖作為糖基供體進行體外反應,結果表明,UGT109A1可以將糖基轉移到人參皂苷Re和人參皂苷R1的C-3位OH上,也可以將糖基轉移到人參皂苷 Rf和人參皂苷Rh1的C-3位羥基和C-12位羥基上,產物中包括多種非天然的人參皂苷[46]。此外,也有研究者利用酵母內源的糖基轉移酶UGT51來生產人參皂苷,通過解析UGT51的晶體結構,并依據晶體結構對其進行半理性設計,將其體外催化原人參二醇生成人參皂苷 Rh2的效率提高了1800倍,通過將改造后的糖基轉移酶UGT51導入到具備了原人參二醇合成途徑的釀酒酵母中,使得釀酒酵母生產人參皂苷Rh2的產量從0.0032 mg/g DCW (Dry Cell Weight)增加到0.39 mg/g DCW[47]。這些研究顯示出了底物雜泛性的酶在植物三萜皂苷類天然產物異源合成中的巨大潛力,為利用底物雜泛性的酶進行天然產物合成提供了指導。

  2 糖基轉移酶與三萜皂苷的合成

  三萜皂苷由疏水的皂苷元連接一個或多個糖基構成,其中糖基轉移酶在這一過程中起著重要作用,糖基化改變了植物中三萜化合物的一些理化性質和生物活性[48]。

  糖基轉移酶是一類將活化的糖基供體轉移到受體分子上的酶,為糖基轉移酶提供糖基供體的分子較多,其中主要分為核苷酸糖和磷酸酯糖以及磷酸化的糖[49],其中以UDP-糖作為糖基供體的一類糖基轉移酶命名為UDP-糖基轉移酶[50]。糖基化反應在自然界分布廣泛,其受體包括蛋白質、脂質、核酸以及一些天然小分子(主要是一些次級代謝產物)等[51]。糖基化化合物在生物體內直接發揮廣泛功能,包括儲存能量、維護細胞結構的完整性、信息存儲與傳輸、分子識別、細胞之間相互作用、細胞調節、免疫反應、毒性和化學防御等[8,51,52]。

  2.1 糖基轉移酶的分類及催化機理

  糖基化一般參與天然產物合成過程中的最后一步反應,有助于形成植物次級代謝產物的多樣性。目前普遍認可的糖基轉移酶分類方法是按照氨基酸序列相似度來進行分類,CAZy數據庫()對已報道的糖基轉移酶進行了分類,根據氨基酸序列相似度、催化機制等差異,將其分為106個家族[48]。而根據糖基轉移酶所催化形成的糖苷鍵類型分類,又可分為O-糖苷鍵類糖基轉移酶、N-糖苷鍵類糖基轉移酶、S-糖苷鍵類糖基轉移酶、C-糖苷鍵類糖基轉移酶等,其中,催化植物天然產物形成的糖基轉移酶以O-糖苷鍵型為主,少數為N-糖苷鍵型和S-糖苷鍵型[51]。

  糖基轉移酶催化糖基轉移到親核的糖基受體上,以糖基供體上的異頭碳構象在轉移到糖基受體上是否發生改變可將糖基轉移酶分為保留型和反轉型,若構象不發生變化即為保留型,構象發生改變即為反轉型[51](圖3)。反轉型糖基轉移酶采用的是直接置換SN2樣反應,酶催化活性位點氨基酸的側鏈作為堿基,對受體進行親核攻擊,形成過渡態,隨后催化基質從受體基質上奪取一個質子促使對糖異構體進行親核攻擊,并促使糖苷鍵形成,構象發生改變。對于保留型的糖基轉移酶的催化機制尚無定論,一種假設是保留型糖基轉移酶遵循雙置換理論,即糖基和酶先形成共價中間體,后轉移到受體分子上形成糖苷鍵[10]。

  接下來將以三類典型三萜皂苷的合成為例,介紹糖基轉移酶的挖掘及應用。

  圖3 反轉型和保留型糖基轉移酶催化機制  

  Fig。3 Inverting and retaining glycosyltransferase catalysis mechanism

  2.2 糖基轉移酶在三萜皂苷合成中的應用

  2。2。1 人參皂苷合成相關的糖基轉移酶

  人參是我國名貴中藥,被譽為“神草”,人參對于調節血壓、代謝、免疫等方面均有作用[53,54],但直到人參皂苷類化合物從人參中被提取出來,人參的藥用機理才被證實[53],其中的人參皂苷類化合物被確定是人參發揮提高免疫力[53]、降血壓[53]、抗腫瘤等功效的主要物質[4,53,55,56,57]。在2013年,Dai等[28]通過在釀酒酵母中引入來自于人參的達瑪烯二醇-II合酶基因和原人參二醇合酶基因以及來自于擬南芥的NADPH-細胞色素P450還原酶基因,成功地在釀酒酵母中構建了原人參二醇(PPD)合成路徑,原人參二醇產量達到了0.05 mg/g DCW,之后,又通過過表達截短的3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A還原酶基因、法尼基焦磷酸合酶基因、鯊烯合酶基因、2,3-氧化鯊烯合酶基因來增加前體鯊烯和2,3-氧化鯊烯的供應,并通過對原人參二醇合酶基因進行密碼子優化提高了該酶在釀酒酵母中的表達量,這些策略共同使得原人參二醇的產量提高了262倍。最后,通過兩相發酵的方法使得原人參二醇的產量達到了8.40 mg/g DCW (1189 mg/L),達瑪烯二醇-II的產量達到了10.94 mg/g DCW (1548 mg/L),該研究為利用釀酒酵母生產人參皂苷提供了基礎。2015年,中國科學院上海植物生理生態研究所和中國科學院上海藥物研究所以及復旦大學生命科學學院和生物醫學科學研究所聯合合作,從人參中克隆得到了兩個UGT基因,其中UGTPg45選擇性地將葡萄糖基轉移到原人參二醇及其人參皂苷的C3羥基上,UGTPg29選擇性地將一個葡萄糖基團轉移到Rh2的C3位的葡萄糖基團上。基于此,將這兩個糖基轉移酶基因轉移到可以合成原人參二醇的釀酒酵母中,實現了利用葡萄糖來生產稀有的人參皂苷Rh2和Rg3[58]。此后,該研究團隊通過對釀酒酵母底盤宿主的MVA途徑進行優化以及提高CYP450基因表達水平,原人參二醇的搖瓶產量達到了529.0 mg/L,在10L發酵罐產量可達到11.02 g/L,極大地提高了人參皂苷的前體原人參二醇的供應量。通過增加糖基轉移酶UGTPg45的基因拷貝數及對其進行啟動子工程改造,并通過對UGTPg45進行定向進化提高其催化效率,此外,通過挖掘新的糖基轉移酶UGTPn50,在這些策略的共同作用下,同時利用兩個酶生產人參皂苷Rh2,搖瓶產量達到了179.3 mg/L,在10L 發酵罐中產量達到了2.25 g/L [30]。2014年,Zhou等人通過從NCBI數據庫公布的人參基因數據庫中挖掘到了479689個組裝的cDNA序列,通過利用植物次級代謝產物糖基轉移酶保守序列(PSPG-box)確定了512個潛在的UGT編碼序列,并克隆得到了16個基因序列,在這些序列中發現了一個可以催化生成人參皂苷CK的糖基轉移酶UGTPg1[59]。此后,研究者還分別在釀酒酵母[47]、枯草芽孢桿菌[46]等微生物中發現了一些底物雜泛性的酶,分別可以催化生成人參皂苷Rh2和一些非天然的人參皂苷產物。這些研究較全面的地解析了相關人參皂苷的合成路徑,為實現天然產物的合成生物學制造及利用微生物生產天然產物提供了范例。

  2.2.2 甘草次酸衍生物合成相關的糖基轉移酶

  甘草是我國傳統中藥,有著“十方九草”的美譽。研究發現,甘草及提取自甘草的活性成分具備祛痰[60]、平喘[61]、抗病毒[62]和保肝護肝[63]等功效。甘草中的皂苷類化合物含量在5%-11%不等[64]。目前,在甘草中分離得到的三萜皂苷均為齊墩果烷型三萜苷元的衍生物[64]。其中,以甘草次酸作為苷元的三萜皂苷類化合物占比例較大。此前,甘草次酸合成相關的關鍵酶及合成途徑已相繼被解析[65,66,67],甘草次酸是甘草酸的苷元,在糖基轉移酶的作用下,兩個葡萄糖醛酸基團被轉移到甘草次酸的C-3位OH上,得到甘草酸(圖1)。目前,與甘草酸合成相關的糖基轉移酶的報導較少,在2016年,Xu等[68]報導了在甘草中挖掘到了一種新的糖基轉移酶,該酶可以催化連續兩步的轉糖基反應,但相關研究未見后續報導。在2018年,He等人[69]通過對已報道的的烏拉爾甘草轉錄組數據進行分析來挖掘可以形成C-30位酯鍵的糖基轉移酶基因,在43個候選基因中,成功克隆得到了16個基因,以甘草酸作為糖基受體,以UDP-葡萄糖作為糖基受體,驗證挖掘到的新的糖基轉移酶的催化活性,最終篩選得到了一個新的糖基轉移酶UGT73F17,該酶可將葡萄糖基團轉移到甘草酸的30位羥基上,生成甘草皂苷A3,UGT73F17對五環三萜類化合物的C-30/C-29的羧基具有嚴格的區域特異性,并對糖基供體表現出高度的雜泛性,且該酶只能催化齊墩果烷型三萜及其衍生物的C29/30位糖基化。除此之外,Liu等[70]報導了利用來自于歐洲山芥的糖基轉移酶BVEc催化甘草次酸生成其糖基化衍生物,糖基轉移酶BVEc可以將葡萄糖基轉移到甘草次酸的3號位上,生成3-O-單葡萄糖基甘草次酸。這些研究對探索甘草中三萜皂苷類化合物合成方式具有指導意義。

  2.2.3 大豆皂苷及其相關糖基轉移酶

  大豆中主要的皂苷類化合物就是大豆皂苷,根據其苷元不同被分為DDMP型皂苷和Group A皂苷,DDMP皂苷以大豆甾醇B作為苷元,Group A皂苷以大豆甾醇A作為苷元。DDMP皂苷及其衍生物對人體健康有一定的益處[71,72],部分Group A類皂苷因其澀味而影響其口感[2]。大豆皂苷βg是典型的DDMP型皂苷,也是大豆中的主要的皂苷,在大豆甾醇B的3號位羥基上連接著三種糖基——葡萄糖醛酸基、半乳糖基和鼠李糖基,UGT73P2和UGT91H4分別負責轉移第二個和第三個糖基到糖鏈上[73],而關于在大豆皂苷三號位上轉移葡萄糖醛酸基團的糖基轉移酶曾在大豆微粒體中被檢測到[74],但是相關基因信息尚未被報導。除了C-3位的糖基化,Group A皂苷的C-22位羥基也可與糖基結合,Sayama 等[75] 報導了UGT73F4和UGT73F2可分別將木糖和葡萄糖轉移到已經與C-22位羥基結合的阿拉伯糖上,但負責將阿拉伯糖基轉移到C-22位羥基上的糖基轉移酶尚未被解析。

  3 展望

  利用合成生物學和代謝工程手段,設計快速、便捷的異源合成三萜皂苷類化合物的方法有著巨大的應用前景,在這個過程中,糖基轉移酶起著關鍵作用。由于糖基轉移酶具有獨特的區域選擇性和立體選擇性,因此,在解析酶的晶體結構基礎上,闡明不同的糖基轉移酶在三萜皂苷的不同位置和不同寡糖鏈形成中的催化機制對于高效合成三萜皂苷及新型皂苷類化合物具有重要意義。目前,研究較多的糖基轉移酶主要是參與形成O-糖苷鍵的糖基轉移酶,但對于參與形成N-糖苷鍵、S-糖苷鍵以及C-糖苷鍵的糖基轉移酶的研究較少,這類糖基轉移酶對于合成新的糖苷化合物,特別是對于人體具有生物活性物質來說是極具吸引力的。

  綜上所述,當前采用合成生物學方法,利用糖基轉移酶進行糖基化反應合成三萜皂苷類產物的研究受到廣泛關注。盡管目前通過構建微生物細胞工廠來獲取天然產物的生產方式與預期還有一定差距,對于天然產物合成途徑相關的基因元件的挖掘以及合成路徑的解析還處于初步探索階段,如何精確高效地預測相關基因元件一直是人們面臨的問題。此外,利用微生物細胞工廠獲取植物天然產物的方式還不能完全替代傳統的方法,微生物合成一些天然產物的產量尚不足以達到工業化要求。但可以預見,伴隨著合成生物學和代謝工程的發展,以及高通量測序技術和代謝組學技術的發展,非模式植物的基因組和轉錄組的測序將會更加高效準確,通過對這些基因組、轉錄組數據進行挖掘,有望加快三萜皂苷生物合成相關的新基因的發現,對于三萜皂苷類天然產物合成途徑的解析也將會逐步深入。伴隨著人工智能理論和技術的發展,未來,通過將人工智能等自動化技術與新基因的挖掘、篩選,代謝途徑的優化,高效細胞工廠的構建結合起來,將大大地降低人力物力耗費、節省時間成本。

  通過挖掘相關基因元件,設計合成路徑來構建細胞工廠,高效獲取這類天然產物將繼續成為未來一段時間的研究方向。近些年,隨著酵母等微生物用于生產植物天然產物方面取得了顯著進展,重組酵母的三萜皂苷途徑工程有望發展成為一種適合于三萜皂苷類化合物工業化生產的工藝。相信在不久的將來,人們將迎來一個全新的利用微生物合成植物天然產物的合成生物學時代。

  符 號 說 明

  CYP450——細胞色素P450酶

  DCW——細胞干重

  DMAPP——二甲基烯丙基焦磷酸

  HPLC——高效液相色譜

  IPP——異戊烯基焦磷酸

  MVA——甲羥戊酸

  MEP——甲基赤蘚糖-4-磷酸

  NADPH——還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸

  OSC——氧化鯊烯環化酶

  PPT——原人參三醇

  PSPG-box——植物次級代謝產物糖基轉移酶保守序列

  UGT——尿苷二磷酸糖基轉移酶

  βAS——β-香樹脂醇合酶

  參考文獻

  [1] Vincken J P, Heng L, Groot A D, et al. Saponins, classification and occurrence in the plant kingdom[J]. Phytochemistry, 2007, 68(3): 275-297.
  [2] Sawai S, Saito K. Triterpenoid biosynthesis and engineering in plants[J]. Frontiers in Plant Science, 2011, 2(25): 1-8.
  [3] Gauthier C, Legault J, Pichette A. Recent progress in the synthesis of naturally occurring triterpenoid saponins[J]. Mini-Reviews in Organic Chemistry. 2009, 6(4): 321-344.
  [4] Qi L W, Wang C Z, Yuan C S. Ginsenosides from American ginseng: chemical and pharmacological diversity[J]. Phytochemistry, 2011, 72(8): 689-699.
  [5] Zhao Y J, Lv B, Feng X D, et al. Perspective on biotransformation and de novo biosynthesis of licorice constituents[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2017, 65(51): 11147-11156.
  [6] Itkin M, Davidovich-Rikanati R, Cohen S, et al. The biosynthetic pathway of the nonsugar, high-intensity sweetener mogroside V from Siraitia grosvenorii[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2016, 113(47): E7619-E7628.
  [7] Scognamiglio M, D'Abrosca B, Fiumano V, et al. Oleanane saponins from Bellis sylvestris Cyr. and evaluation of their phytotoxicity on Aegilops geniculata Roth[J]. Phytochemistry, 2012, 84(12): 125-134.
  [8] Zhao Y J, Li C. Biosynthesis of plant triterpenoid saponins in microbial cell factories[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2018, 66(46): 12155?12165.
  [9] Szakiel A, P?czkowski C, Henry M. Influence of environmental biotic factors on the content of saponins in plants[J]. Phytochemistry Reviews, 2011, 10(4): 471-491.
  [10] Lairson L L, Henrissat B, Davies G J, et al. Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms[J]. Annual Review of Biochemistry, 2008, 77: 521-555.
  [11] Roberts S C. Production and engineering of terpenoids in plant cell culture[J]. Nature Chemical Biology, 2007, 3(7): 387-395.
  [12] Zhao F L, Bai P, Nan W H, et al. A modular engineering strategy for high‐level production of protopanaxadiol from ethanol by Saccharomyces cerevisiae[J]. AIChE Journal, 2019, 65(3): 866-874.
  [13] Kuzina V, Ekstr?m C T, Andersen S B. Identification of defense compounds in Barbarea vulgaris against the herbivore Phyllotreta nemorum by an ecometabolomic approach[J]. Plant Physiology, 2009, 151(4): 1977-1990.
  [14] Augustin J M, Sylvia D, Tetsuro S, et al. UDP-glycosyltransferases from the UGT73C subfamily in Barbarea vulgaris catalyze sapogenin 3-O-glucosylation in saponin-mediated insect resistance[J]. Plant Physiology, 2012, 160(4): 1881-1895.
  [15] Xu J, Wang X D, Zhang H Y, et al. Synthesis of triterpenoid derivatives and their anti-tumor and anti-hepatic fibrosis activities[J]. Natural Product Research, 2018: 1-7.DOI:10.1080/14786419.2018.1499642.
  [16] 戴住波, 王勇, 周志華, 等. 植物天然產物合成生物學研究[J]. 中國科學院院刊, 2018, 33(11): 106-116.
  [17] Zhang S P, Wu Y Y, Jin J, et al. De novo characterization of Panax japonicus C. A. Mey transcriptome and genes related to triterpenoid saponin biosynthesis[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2015, 466(3): 450-455.
  [18] Gül?in ?, Mshvildadze V, Gepdiremen A, et al. The antioxidant activity of a triterpenoid glycoside isolated from the berries of Hedera colchica: 3-O-(beta-D-glucopyranosyl)-hederagenin[J]. Phytotherapy Research, 2006, 20(2): 130-134.
  [19] Cheng L, Liang S, Wu J, et al. A hederagenin saponin isolated from Clematis ganpiniana induces apoptosis in breast cancer cells via the mitochondrial pathway[J]. Oncology Letters, 2018, 15(2): 1737-1743.
  [20] 劉家鑫, 陳明明, 楊雪艷, 等. 常春藤藥材HPLC指紋圖譜及8種成分的含量測定方法[J]. 沈陽藥科大學學報, 2017, 34(11): 979-986.
  [21] 田慶來, 官月平, 張波, 等. 甘草有效成分的藥理作用研究進展[J]. 天然產物研究與開發, 2006,18(2): 343-347.
  [22] 崔杏雨, 崔健, 陳樹偉. 甘草酸制備新工藝的研究[J]. 太原理工大學學報, 2001, 32(3): 271-273.
  [23] 韓金玉, 劉翀, 王華, 等. 正相液相制備色譜分離純化三七葉甙中人參皂甙單體Rb3[J]. 高校化學工程學報, 2005, 19(2): 192-196.
  [24] 孟祥穎, 劉銀燕. 氮, 磷, 鉀配合施用對人參質量影響的研究[J]. 質量指南, 1996, (6): 36-37.
  [25] 張治安,徐克章. 光照條件對參株碳水化合物和人參皂甙含量的影響[J]. 吉林農業大學學報, 1994, (3): 15-17.
  [26] 邢建民, 趙德修, 李茂寅, 等. 植物細胞培養生產黃酮類化合物研究進展[J]. 中國生物工程雜志, 2001, 21(1): 47-50.
  [27] Paddon C J, Westfall P J, Pitera D J, et al. High-level semi-synthetic production of the potent antimalarial artemisinin[J]. Nature, 2013, 496(7446): 528.
  [28] Dai Z B, Liu Y, Zhang X A, et al. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for production of ginsenosides[J]. Metabolic Engineering, 2013, 20: 146-156.
  [29] Dai Z B, Wang B B, Liu Y, et al. Producing aglycons of ginsenosides in bakers’yeast[J]. Scientific Reports, 2014, 4: 3698.
  [30] Wang P P, Wei W, Ye W, et al. Synthesizing ginsenoside Rh2 in Saccharomyces cerevisiae cell factory at high-efficiency[J]. Cell Discovery, 2019, 5(1): 5.
  [31] Jung S C, Kim W, Park S C, et al. Two ginseng UDP-glycosyltransferases synthesize ginsenoside Rg3 and Rd[J]. Plant and Cell Physiology, 2014, 55(12): 2177-2188.
  [32] Kim O T, Um Y, Jin M L, et al. A novel multifunctional C-23 oxidase, CYP714E19, is involved in asiaticoside biosynthesis[J]. Plant and Cell Physiology, 2018, 59(6): 1200-1213.
  [33] Kim O T, Jin M L, Lee D Y, et al. Characterization of the asiatic acid glucosyltransferase, UGT73AH1, involved in asiaticoside biosynthesis in Centella asiatica (L.) Urban[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2017, 18(12): 2630.
  [34] Han J Y, Chun J H, Oh S A, et al. Transcriptomic analysis of Kalopanax septemlobus and characterization of KsBAS, CYP716A94 and CYP72A397 genes involved in hederagenin saponin biosynthesis[J]. Plant and Cell Physiology, 2017, 59(2): 319–330.
  [35] Erthmann P ?, Agerbirk N, Bak S. A tandem array of UDP-glycosyltransferases from the UGT73C subfamily glycosylate sapogenins, forming a spectrum of mono- and bisdesmosidic saponins[J]. Plant Molecular Biology, 2018, 97(1/2): 1-19.
  [36] Liu Q, Khakimov B, Cárdenas P D, et al. The cytochrome P450 CYP72A552 is key to production of hederagenin‐based saponins that mediate plant defense against herbivores[J]. New Phytologist, 2019, 222(3): 1599-1609.
  [37] Sun W T, Qin L, Xue H J, et al. Novel trends for producing plant triterpenoids in yeast[J]. Critical Reviews in Biotechnology, 2019, 39(5): 618-632.
  [38] Augustin J M, Kuzina V, Andersen S B, et al. Molecular activities, biosynthesis and evolution of triterpenoid saponins[J]. Phytochemistry, 2011, 72(6): 435-457.
  [39] Seki H, Tamura K, Muranaka T. P450s and UGTs: key players in the structural diversity of triterpenoid saponins[J]. Plant and Cell Physiology, 2015, 56(8): 1463-1471.
  [40] Jeena G S, SFatima, Tripathi P, et al. Comparative transcriptome analysis of shoot and root tissue of Bacopa monnieri identifies potential genes related to triterpenoid saponin biosynthesis[J]. BMC Genomics, 2017, 18(1): 490.
  [41] Luo H M, Sun C, Sun Y Z, et al. Analysis of the transcriptome of Panax notoginseng root uncovers putative triterpene saponin-biosynthetic genes and genetic markers[J]. BMC Genomics, 2011, 12(5): S5.
  [42] Moses T, Pollier J, Faizal A, et al. Unraveling the triterpenoid saponin biosynthesis of the African shrub Maesa lanceolata[J]. Molecular Plant, 2015, 8(1): 122-135.
  [43] Liu Y L, Zhang P F, Song M L, et al. Transcriptome analysis and development of SSR molecular markers in Glycyrrhiza uralensis Fisch[J]. Plos One, 2015, 10(11): e0143017.
  [44] Tang Q Y, Chen G, Song W L, et al. Transcriptome analysis of Panax zingiberensis identifies genes encoding oleanolic acid glucuronosyltransferase involved in the biosynthesis of oleanane-type ginsenosides[J]. Planta, 2018, 249(2): 393–406.
  [45] Dai L H, Li J, Yang J G, et al. Use of a promiscuous glycosyltransferase from Bacillus subtilis 168 for the enzymatic synthesis of novel protopanaxatriol-type ginsenosides[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2018, 66(4): 943?949.
  [46] Zhang T T, Gong T, Hu Z F, et al. Enzymatic synthesis of unnatural ginsenosides using a promiscuous UDP-glucosyltransferase from Bacillus subtilis[J]. Molecules, 2018, 23(11): 2797.
  [47] Zhuang Y, Yang G Y, Chen X H, et al. Biosynthesis of plant-derived ginsenoside Rh2 in yeast via repurposing a key promiscuous microbial enzyme[J]. Metabolic Engineering, 2017, 42: 25-32.
  [48] Rahimi S, Kim J, Mijakovic I, et al. Triterpenoid-biosynthetic UDP-glycosyltransferases from plants[J]. Biotechnology Advances, 2019. DOI:org/10.1016/j.biotechadv.2019.04.016.
  [49] Gloster T M. Advances in understanding glycosyltransferases from a structural perspective[J]. Current Opinion in Structural Biology, 2014, 28: 131-141.
  [50] Meech R, Hu D G, McKinnon R A, et al. The UDP-glycosyltransferase (UGT) superfamily: new members, new functions, and novel paradigms[J]. Physiological Reviews, 2019, 99(2): 1153-1222.
  [51] Liang D M, Liu J H, Wu H, et al. Glycosyltransferases: mechanisms and applications in natural product development[J]. Chemical Society Reviews, 2015, 44(22): 8350-8374.
  [52] Osbourn A. Saponins and plant defence — a soap story[J]. Trends in Plant Science, 1996, 1(1): 4-9.
  [53] Leung K W, Wong A S T. Pharmacology of ginsenosides: a literature review[J]. Chinese Medicine, 2010, 5(1): 20.
  [54] Lu J, Yao L, Li J X, et al. Characterization of UDP-glycosyltransferase involved in biosynthesis of ginsenosides Rg1 and Rb1 and identification of critical conserved amino acid residues for its function[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2018, 66(36): 9446-9455.
  [55] Xu Q F, Fang X L, Chen D F. Pharmacokinetics and bioavailability of ginsenoside Rb1 and Rg1 from Panax notoginseng in rats[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2003, 84(2): 187-192.
  [56] Lee S J, Lee J S, Lee E, et al. The ginsenoside metabolite compound K inhibits hormone-independent breast cancer through downregulation of cyclin D1[J]. Journal of Functional Foods, 2018, 46: 159-166.
  [57] Liao L M, Zhang Y, Lin S F, et al. Enzymatic Transformation from protopanaxadiol ginsenoside Rb1 into rare ginsenoside C-K and its anti-cancer activity[J]. Advanced Materials Research, 2013, 641: 752-755.
  [58] Wang P P, Wei Y J, Fan Y, et al. Production of bioactive ginsenosides Rh2 and Rg3 by metabolically engineered yeasts[J]. Metabolic Engineering, 2015, 29: 97-105.
  [59] Yan X, Fan Y, Wei W, et al. Production of bioactive ginsenoside compound K in metabolically engineered yeast[J]. Cell Research, 2014, 24(6): 770.
  [60] 高雪巖, 王文全, 魏勝利, 等. 甘草及其活性成分的藥理活性研究進展[J]. 中國中藥雜志, 2009, 34(21): 2695-2700.
  [61] Armanini D, Fiore C, Mattarello M J, et al. History of the endocrine effects of licorice[J]. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes. 2002, 110(06): 257-261.
  [62] Cinatl J, Morgenstern B, Bauer G, et al. Glycyrrhizin, an active component of liquorice roots, and replication of SARS-associated coronavirus[J]. The Lancet, 2003, 361(9374): 2045-2046.
  [63] Mabuchi A, Wake K, Marlini M, et al. Protection by glycyrrhizin against warm ischemia-reperfusion-induced cellular injury and derangement of the microcirculatory blood flow in the rat liver[J]. Microcirculation, 2010, 16(4): 364-376.
  [64] 謝彥, 徐淑永,曾和平. 甘草屬植物中三萜類化合物研究概述[J]. 廣州化工, 2004,32(1): 1-5.
  [65] Zhu M, Wang C X, Sun W T, et al. Boosting 11-oxo-β-amyrin and glycyrrhetinic acid synthesis in Saccharomyces cerevisiae via pairing novel oxidation and reduction system from legume plants[J]. Metabolic Engineering, 2018, 45: 43-50.
  [66] Seki H, Sawai S, Ohyama K, et al. Triterpene functional genomics in licorice for identification of CYP72A154 involved in the biosynthesis of glycyrrhizin[J]. The Plant Cell, 2011, 23(11): 4112-4123.
  [67] Seki H, Ohyama K, Sawai S, et al. Licorice β-amyrin 11-oxidase, a cytochrome P450 with a key role in the biosynthesis of the triterpene sweetener glycyrrhizin[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2008, 105(37): 14204-14209.
  [68] Xu G J, Cai W, Gao W, et al. A novel glucuronosyltransferase has an unprecedented ability to catalyse continuous two-step glucuronosylation of glycyrrhetinic acid to yield glycyrrhizin[J]. New Phytologist, 2016, 212(1): 123–135.
  [69] He J B, Chen K, Hu Z M, et al. UGT73F17, a new glycosyltransferase from Glycyrrhiza uralensis, catalyzes the regiospecific glycosylation of pentacyclic triterpenoids[J]. Chemical Communications, 2018, 54(62): 8594-8597.
  [70] Liu X C, Zhang L, Feng X D, et al. Biosynthesis of glycyrrhetinic acid-3-O-monoglucose using glycosyltransferase UGT73C11 from Barbarea vulgaris[J]. Industrial & Engineering Chemistry Research, 2017, 56(51): 14949-14958.
  [71] Lee S O, Simons A L, Murphy P A, et al. Soyasaponins lowered plasma cholesterol and increased fecal bile acids in female golden Syrian hamsters[J]. Experimental Biology and Medicine, 2005, 230(7): 472-478.
  [72] Kinjo J, Imagire M, Udayama M, et al. Structure-hepatoprotective relationships study of soyasaponins I-IV having soyasapogenol B as aglycone[J]. Planta Medica, 1998, 64(03): 233-236.
  [73] Shibuya M, Nishimura K, Yasuyama N, et al. Identification and characterization of glycosyltransferases involved in the biosynthesis of soyasapoin I in Glycine max[J]. FEBS Letters, 2010, 584(11): 2258-2264.
  [74] Kurosawa Y, Takahara H, Shiraiwa M. UDP-glucuronic acid: soyasapogenol glucuronosyltransferase involved in saponin biosynthesis in germinating soybean seeds[J]. Planta, 2002, 215(4): 620–629.
  [75] Sayama T, Ono E, Takagi K, et al. The Sg-1 glycosyltransferase locus regulates structural diversity of triterpenoid saponins of soybean[J]. The Plant Cell, 2012, 24(5): 2123–2138.

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