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復凝聚反應在溶菌酶分離中的應用
添加時間:2019-08-21

  摘要:以溶菌酶為分離對象, 將海藻酸鈉溶液滴入CaCl2溶液中使其快速完成凝膠反應形成微球, 研究各種條件對其溶菌酶吸附容量的影響。結果表明, 當海藻酸鈉溶液濃度為2% (w/v) 、CaCl2溶液濃度為2% (w/v) 、Ca2+交聯時間為90min、溶菌酶溶液pH為6時, 所得海藻酸鈉微球對溶菌酶的吸附容量最大, 達到了57.56mg/g海藻酸鈉。將該微球用于雞蛋清中蛋白質的吸附, 蛋白質的吸附量達到了69.47mg/g海藻酸鈉。因此, 海藻酸鈉微球在溶菌酶的分離純化中具有較強的應用前景。

  關鍵詞:海藻酸鈉; 微球; 吸附; 溶菌酶;

  作者簡介: 甄天元 (1975—) , 男, 山東濟寧人, 碩士, 講師, 研究方向:食品保鮮技術, E-mail:tianyuan82877@163.com; *黃國清 (1978—) , 男, 湖北荊州人, 博士、副教授, 研究方向:微囊化技術, E-mail:hgqfood@qau.edu.cn;

  收稿日期:2019-04-10

  基金: 山東省重點研發計劃 (醫用食品) 項目 (2018YYSP013); 山東省自然科學基金重大基礎研究項目 (ZR2018ZC0945); 國家自然科學基金面上項目 (31571890);

  Study on the Adsorption of Lysozyme by Sodium Alginate Microspheres and Its Application

  ZHEN Tianyuan ZHANG Peizhi HAN Rongwei WANG Jun HOU Xiudan XIAO Junxia HUANG Guoqing

  College of Food Science and Engineering, Qingdao Agricultural University

  Abstract:In this paper, lysozyme was used as the object of separation.Sodium alginate solution was dropped into CaCl2 solution to rapidly complete the gel reaction to form microspheres, and the effects of various conditions on the lysozyme adsorption capacity were studied.Results showed that when sodium alginate solution of 2% (w/v) , CaCl2 solution of 2% (w/v) , Ca2+crosslinking time for 90 min, lysozyme solution pH of 6.0, the sodium alginate microspheres of lysozyme adsorption capacity was the largest, reached 57.56 mg/g sodium alginate.The microspheres were used for protein adsorption in egg whites, and the amount of protein adsorbed reached 69.47 mg/g sodium alginate.Therefore, sodium alginate microspheres have a strong application prospect in the separation and purification of lysozyme.

  Keyword:sodium alginate; microspheres; adsorption; lysozyme;

  Received: 2019-04-10

  溶菌酶廣泛存在于自然界中,高等動物組織及其分泌物、植物及各種微生物中均可檢測到溶菌酶的存在,但是其在雞蛋清液中的含量最為豐富[1]。溶菌酶對革蘭氏陽性菌具有很強的抑制作用,并且還具有消炎、抗病毒等功效,因此在食品及醫藥領域具有廣泛用途[2]。

  目前,工業上分離溶菌酶的方法主要有陽離子交換樹脂吸附、親和層析、鹽析、直接結晶、超濾等一系列方法[3],但是近年來復凝聚反應在酶分離中的應用開始引起人們的關注。

  復凝聚反應是指當兩種帶相反電荷的聚電解質在溶液中共存時通過靜電相互作用而發生相分離產生沉淀的過程[4]。由于聚電解質之間的靜電相互作用只在一定的pH值范圍內發生,因此可以利用這種專一性對生物大分子進行分離純化。分離純化過程中,將與目標分子帶相反電荷的聚電解質加入到溶液中,調節pH值使其與目標分子發生復凝聚反應形成沉淀,通過離心分離或者過濾收集聚電解質復合物,即可以達到濃縮和分離目標分子的目的[5],目前復凝聚反應已被用于木瓜蛋白酶[6]、菠蘿蛋白酶[7]、胰凝乳蛋白酶[8]和脂肪酶[9]的分離純化。與傳統的鹽析沉淀和有機溶劑沉淀技術相比,復凝聚反應在酶分離中具有聚電解質用量少、對酶活性影響小、操作簡便、環保等顯著優點,因此被認為是一種極具工業化應用前景的蛋白質預分離和濃縮技術[10]。

  利用復凝聚反應進行酶的分離時,在得到聚電解質復合物沉淀后通常還需要使沉淀重新溶解并進行進一步分離才將得到純度較高的產物,這在一定程度上增加了復凝聚反應在分離中的復雜性。針對這一不足,本文擬采用海藻酸鈉微球作為聚陰離子從溶液中吸附溶菌酶,吸附完成后通過改變pH值或離子強度即可將溶菌酶解吸附,同時海藻酸鈉微球還可循環利用,因此可大大提高復凝聚反應在酶分離中的效率。本文有望為復凝聚反應在溶菌酶分離中的應用提供一定的參考。

  1 材料和方法

  1.1試驗材料

  海藻酸鈉(AR),天津津東天正精細化學試劑廠;考馬斯亮藍G250(AR)、氯化鈣(AR),天津廣成化學試劑有限公司;溶菌酶(BR),泰興市東圣食品科技有限公司。

  1.2試驗儀器

  BSA323S-CW電子天平:德國Sartarius公司;90-3恒溫磁力攪拌器:上海亞榮生化儀器廠;Delta320pH計:梅特勒-托利多公司;HH-2數顯恒溫水浴鍋:龍口市先科儀器公司;7200分光光度計:尤尼柯(上海)儀器有限公司。

  1.3試驗方法

  1.3.1影響海藻酸鈉微球溶菌酶吸附容量的因素

  1.3.1.1海藻酸鈉濃度的影響

  配制濃度分別為1%、1.5%、2%、2.5%、3%(w/v)的不同濃度的海藻酸鈉溶液,各取10mL上述溶液,用14號針頭按照30滴/min的速度滴加到30mL pH值自然的、濃度為2%(w/v)的CaCl2溶液中,滴完后靜置30min,將形成的微球全部撈出,用去離子水反復沖洗后將微球全部放入30mL濃度為1mg/mL的溶菌酶溶液中靜置吸附90min,完成后測定溶菌酶的吸附容量。

  1.3.1.2 CaCl2溶液濃度的影響

  配制濃度為2%(w/v)的海藻酸鈉溶液。取10mL上述溶液,用14號針頭按照30滴/min的速度分別滴加到30mL pH值自然的、濃度為1%、1.5%、2%、2.5%和3%的CaCl2(w/v)溶液中,滴完后靜置30min,將形成的微球撈出,用去離子水反復沖洗后全部放入30mL濃度為1mg/mL的溶菌酶溶液中靜置吸附90min,完成后測定溶菌酶的吸附量。

  1.3.1.3 Ca2+交聯時間的影響

  配制濃度為2%(w/v)的海藻酸鈉溶液。取10mL上述溶液,用14號針頭按照30滴/min的速度分別滴加到30mL pH值自然、濃度為2%的CaCl2(w/v)溶液中,滴完后分別靜置30min、60min、90min、120min,靜置完成后將形成的微球撈出,用去離子水反復沖洗后全部放入30mL濃度為1mg/mL的溶菌酶溶液中靜置吸附90min,完成后測定溶液中的溶菌酶含量,計算吸附容量。

  1.3.1.4吸附時間的影響

  配制濃度為2%(w/v)的海藻酸鈉溶液。取10mL上述溶液,用14號針頭按照30滴/min的速度分別滴加到30mL pH值自然、濃度為2%的CaCl2(w/v)溶液中,滴完后靜置90min,靜置完成后將形成的微球全部撈出,用去離子水反復沖洗后放入30mL濃度為1mg/mL的溶菌酶溶液中靜置吸附,吸附時間分別為30min、60min、90min、120min,完成后測定溶液中的溶菌酶含量,計算吸附容量。

  1.3.1.5溶菌酶溶液pH值的影響

  配制濃度為2%(w/v)的海藻酸鈉溶液。取10mL上述溶液,用14號針頭按照30滴/min的速度分別滴加到30mL pH值自然的、濃度為2%CaCl2(w/v)溶液中,滴完后靜置90min,靜置完成后將形成的微球撈出,用去離子水反復沖洗后放入30mL pH值分別為3、4、5、6、7、8、9、10、11的濃度為1mg/mL的溶菌菌溶液中靜置吸附120min,完成后測定溶液中的溶菌酶含量,計算吸附容量。

  1.3.2溶菌酶含量的測定和吸附容量的計算

  吸取吸附完成前后的溶菌酶溶液各1mL,分別加入5mL考馬斯亮藍溶液于試管,充分震蕩,在5~10 min內進行595nm下吸光度的測定,根據BSA標準曲線得到相應的蛋白含量。吸附容量(a)按以下公式計算:

  式中:cbefore指吸附前溶液中溶菌酶的量,mg;cafter指吸附后溶液中溶菌酶的量,mg;mSAL指制備凝膠微球所用海藻酸鈉的量,g。

  1.3.3應用試驗

  1.3.3.1雞蛋清溶液的配制

  在蛋清溶液中加入蛋清液體積兩倍的蒸餾水,攪勻,初次過濾除去不溶性雜質和絮狀蛋白,加入重量濃度為5%~10%的酸來調節溶液的pH,使蛋清溶液pH保持在4~5之間,靜置15~20min,再次過濾除去靜置產生的沉淀,對濾液進行水浴加熱,使濾液溫度達到75~80℃,使雜蛋白受熱變性而沉淀,靜置冷卻至室溫,繼續靜置不少于10h,之后過濾除去生成的沉淀得到上清液。

  1.3.3.2蛋白質的吸附

  配制濃度為2%(w/v)的海藻酸鈉溶液。取10mL上述溶液,用14號針頭按照30滴/min的速度分別滴加到30mL pH值自然、濃度為2%的CaCl2(w/v)溶液中,滴完后靜置90min,靜置完成后將形成的微球撈出,用去離子水反復沖洗后放入30mL pH值為6的雞蛋清溶液中,靜置吸附120min,測定吸附前后溶液中的蛋白質含量,計算吸附量。

  1.3.3.3吸附量的測定

  分別取吸附前后的蛋清液1mL,加入5mL考馬斯亮藍溶液充分震蕩,5~10min內在595nm下進行吸光度的測定,根據BSA標準曲線計算得出相應蛋白含量,根據1.4中的公式計算吸附量。

  1.4數據處理

  本論文中所有實驗數據均有三個平行,最終數值以平均值±標準差形式表示,用OriginPro Portable作圖,用SPSS 16.0統計軟件對數據(t檢驗)進行顯著性分析,當p<0.05時認為差異顯著。

  2 結果與分析

  2.1海藻酸鈉溶液濃度對微球溶菌酶吸附容量的影響

  海藻酸鈉溶液濃度對相應微球溶菌酶吸附容量的影響如圖1所示。當海藻酸鈉溶液濃度由1%增加至2%時,溶菌酶的吸附容量隨著海藻酸鈉溶液濃度的升高而增大,其數值從35.67mg/g海藻酸鈉上升至48.54mg/g海藻酸鈉;當海藻酸鈉溶液濃度進一步增加時,相應微球對溶菌酶的吸附容量顯著下降,在海藻酸鈉溶液濃度為3%時僅為30.1mg/g海藻酸鈉。這表明海藻酸鈉溶液濃度過高并不利于溶菌酶的吸附。這可能是由于當海藻酸鈉濃度過高時微球的結構過于致密,影響了溶液中溶菌酶向微球內部的遷移,從而導致溶菌酶的吸附量開始下降;另外,當濃度超過2%時海藻酸鈉處于過量狀態也可能是吸附容量下降的另一原因。

 

  圖1 海藻酸鈉溶液濃度對微球溶菌酶吸附容量的影響  

  Fig.1 Effect of sodium alginate solution concentration on the lysozyme adsorption capacity of resultant microspheres

  2.2 CaCl2溶液濃度對海藻酸鈉微球溶菌酶吸附容量的影響

  CaCl2溶液濃度對相應海藻酸鈉微球溶菌酶吸附容量的影響情況如圖2所示。與海藻酸鈉溶液濃度的影響類似,當CaCl2溶液濃度由1%增加至2%時,海藻酸鈉凝膠微球對溶菌酶的吸附容量從33.65mg/g海藻酸鈉增加到45.1mg/g海藻酸鈉;但是當CaCl2溶液濃度進一步增加時,微球對溶菌酶的吸附容量開始下降,且在3%時僅為28.66mg/g海藻酸鈉。這可能是由于當CaCl2溶液濃度過高時,與海藻酸鈉凝膠微球的交聯過于致密,使得溶菌酶無法大量進入到海藻酸鈉微球內部,從而導致吸附容量下降。這一結果與吳文果[1]研究團隊的發現一致。

  

  圖2 CaCl2濃度對海藻酸鈉微球溶菌酶吸附容量的影響  

  Fig.2 Effect of CaCl2concentration on the lysozyme adsorption capacity of sodium alginate microspheres

  2.3 CaCl2交聯時間對海藻酸鈉微球溶菌酶吸附容量的影響

  CaCl2交聯時間對海藻酸鈉微球溶菌酶吸附容量的影響如圖3所示。當交聯時間范圍為30~90min時,隨著交聯時間的延長,相應微球對溶菌酶的吸附容量從36.18mg/g海藻酸鈉增加到49.4mg/g海藻酸鈉;但是當交聯時間進一步延長時,海藻酸鈉微球對溶菌酶的吸附容量開始降低,當交聯時間為120min時降至42.61mg/g海藻酸鈉,其原因與CaCl2溶液濃度(圖2)的影響一致。

 

  圖3 CaCl2交聯時間對海藻酸鈉微球溶菌酶吸附容量的影響  

  Fig.3 Effect of CaCl2crosslinking time on the lysozyme adsorption capacity of sodium alginate microspheres

  2.4吸附時間對海藻酸鈉微球溶菌酶吸附容量的影響

  吸附時間對溶菌酶吸附容量的影響結果如圖4所示。在本文選擇的時間范圍內,海藻酸鈉微球對溶菌酶的吸附容量隨著吸附時間的延長而增加。當吸附時間為30min時,溶菌酶的吸附容量為33.32mg/g海藻酸鈉;當吸附時間延長至2h后,海藻酸鈉微球對溶菌酶的吸附量達到了57.17mg/g海藻酸鈉。這可能是由于海藻酸鈉微球致密的網絡結構會在一定程度上影響溶菌酶向微球內部的滲透,需要足夠長的時間才能使溶菌酶充分擴散至微球內部。由于吸附時間過長時會有酶活性降低及微生物污染的風險,在后續研究中選擇120min為最佳吸附時間。

  2.5溶液pH值對海藻酸鈉微球溶菌酶吸附容量的影響

  海藻酸鈉對溶菌酶的吸附是基于靜電吸引,而pH值會影響兩者的荷電性質和電荷密度,因此會對兩者之間的相互作用造成重要影響。由圖5可知,當體系pH值為3時,海藻酸鈉微球對溶菌酶的吸附容量為25.93mg/g海藻酸鈉;當pH值增加至6時,吸附容量達到最大值57.56mg/g海藻酸鈉;當反應體系pH值進一步增加時,吸附容量隨之顯著降低,當pH值為11時僅為30.00mg/g海藻酸鈉。這表明,在本文確定的條件下,海藻酸鈉從溶液中吸附溶菌酶的最適pH值為6,此時兩者的靜電相互作用最為強烈、溶菌酶的回收率最高。

 

  圖4 吸附時間對海藻酸鈉微球溶菌酶吸附容量的影響  

  Fig.4 Effect of adsorption time on the lysozyme adsorption capacity of sodium alginate microspheres

 

  圖5 pH值對海藻酸鈉微球溶菌酶吸附容量的影響  

  Fig.5 Effect of pH on the lysozyme adsorption capacity of sodium alginate microspheres

  2.6應用研究

  本文還就在最適條件下得到的海藻酸鈉微球對雞蛋清中蛋白質中的吸附情況進行了研究,以便為其在溶菌酶分離中的應用提供依據,結果如表1所示。

  由表1可知,海藻酸鈉微球吸附前雞蛋清溶液中的蛋白質含量為1 200μg/mL,而經最佳條件下制備的海藻酸鈉微球吸附后蛋白質含量降至736.86μg/mL,表明海藻酸鈉微球可有效的從原料中吸附蛋白質;另外,微球中海藻酸鈉對蛋白質的吸附容量達到了69.47mg/g海藻酸鈉,高于其對純溶菌酶的吸附容量,表明雞蛋清中很多雜蛋白也參與了該吸附過程,因此在后續研究中還需要采取進一步的措施以減少雜蛋白的吸附。

  表1 海藻酸鈉微球對雞蛋蛋清溶液中蛋白質的吸附情況    

 

  3 結論

  本文就海藻酸鈉凝膠微球對溶菌酶的吸附條件進行了研究,結果發現,海藻酸鈉凝膠微球吸附溶菌酶的最佳條件為海藻酸鈉溶液濃度為2%、CaCl2溶液濃度為2%、固定化時間為90 min、吸附時間為120min、溶菌酶溶液pH值為6,在此條件下,海藻酸鈉凝膠微球對溶菌酶的吸附容量最大可以達到57.56mg/g海藻酸鈉。將該微球用于雞蛋清中蛋白質有吸附,其吸附容量達到了69.47mg/g海藻酸鈉,表明海藻酸鈉微球可有效的吸附雞蛋清溶液中的蛋白質,但是還需對吸附條件進行優化以提高溶菌酶的吸附量和純度。

  參考文獻

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